Высокоточное аналитическое оборудование
(отдел продаж)
(сервисный отдел)

Преимущества комбинированных измерений SAXS и UV/Vis для анализа биологических образцов

SAXS-UV.jpgМалоугловое рассеяние рентгеновских лучей (SAXS) и спектроскопия УФ и видимом диапазоне (UV/Vis) являются взаимодополняющими методами для определения характеристик, например, биологических молекул в растворе. В то время как SAXS исследует структурные особенности молекул, такие как размер, форма и состояние складчатости, UV/Vis можно использовать для измерения агломерации и концентрации. В этом отчете показаны преимущества использования комбинации на месте обоих методов при исследовании одного и того же объема пробы.

1       Введение

Малоугловое рентгеновское рассеяние (SAXS) является мощным методом в структурной биологии, позволяющим охарактеризовать молекулярную структуру в растворе, то есть в естественном состоянии. SAXS полностью реализует свой потенциал в сочетании с другими методами, которые помогают интерпретировать данные или оценивать монодисперсность частиц.

Абсорбционная спектроскопия ультрафиолетового и видимого света (UV/Vis) является таким дополняющим методом. Как правило, он используется для измерения концентрации молекул или мониторинга изменений образца (например, агрегации) в различных условиях. Спектроскопия UV/Vis может быть выполнена с очень малыми объемами образцов и в ограниченном пространстве, что делает ее идеальной для применения на месте (in situ) в сочетании с другими методами.

Комбинация SAXS с абсорбционной UV/Vis спектроскопией на месте позволяет исследовать образцы с применением обоих методов на одном объеме образца. В качестве примера в этом отчете рассматривается измерение концентрации и мониторинг агрегации образца белка, вызванной повышением температуры.

1.1 Серии концентрации

Молекулы белка - это заряженные частицы, которые имеют тенденцию самоорганизовываться в растворе. Наличие заряда приводит к отталкиванию частиц. Чтобы уменьшить это влияние на данные SAXS, часто измеряют серию образцов с разной концентрацией. Затем измеренные данные экстраполируют до нулевой концентрации. При этом необходимо знать точную концентрацию конкретных образцов.

Концентрацию белка в растворе можно измерить с помощью поглощения УФ-света на длине волны 280 нм. Концентрация напрямую связана с поглощением света законом Ламберта-Бера:

A = εlc

где A - поглощение, ɛ - молярный коэффициент поглощения, l - длина оптического пути, а c - концентрация. Следовательно, измерение UV/Vis поглощения на месте также преобразуется в концентрацию конкретного образца, измеренного методом SAXS.

1.2 Температурная стабильность

Белковые молекулы также могут подвергаться притягивающему взаимодействию, например, агрегации. Агрегация часто приводит к выпадению молекул из раствора в виде осадка, что можно наблюдать оптически. В абсорбционной спектроскопии это выражается в увеличении поглощения в видимом диапазоне в результате рассеяния света на частицах осадка. Для SAXS агрегация чаще всего является эффектом, нарушающим требование монодисперсности; однако только по данным SAXS иногда трудно отличить агрегацию от других эффектов.

В данной работе показано влияние термически индуцированной агрегации белка в растворе на UV/Vis поглощение и SAXS.


2 Детали эксперимента

Рис. 1: SAXSpoint с источником MetalJet.

2.1 Оборудование для эксперимента

 

Измерения проводились с использованием прибора Anton Paar SAXSpoint, оснащенного источником рентгеновского излучения Excillum MetalJet (рис. 1), детектором Dectris EIGER R 1M и специальной платформой для UV/Vis спектроскопии. Платформа представляет собой модифицированную платформу проточного капилляра, которая используется с автоматическим пробоотборником. Температуру образца можно контролировать с помощью элемента Пельтье, встроенного в платформу образца. Поглощение в UV/Vis измеряется ортогонально рентгеновскому лучу в той же области образца. Для получения монохроматического света (190 – 1100 нм), который направляется на к образец с помощью волоконной оптики, используется спектрометр Agilent CaryUV 60. Свет, прошедший через образец, регистрируется с помощью специального детектора, который устанавливается для измерения количества поглощенного света непосредственно в месте прохождения луча, обеспечивая зондирование одного и того же объема образца при измерениях методами как SAXS, так и UV/Vis.

2.2      Измерение

Тиреоглобулин (ТГ) бычьей щитовидной железы (SigmaAldrich) растворяли в 20 мМ Трис, 100 мМ NaCl, pH 7,4 до конечной концентрации 20 мг/мл. Последующее снижение концентрации достигалось добавлением соответствующих количеств буфера. Образцы измеряли в кварцевом капилляре диаметром 1 мм, в который с помощью автосэмплера ASX (-c) автоматически загружали 25 мкл пробы. Затем одновременно измерялись данные SAXS и UV/Vis.

2.3    Измерения концентрации

Исходный раствор разбавляли до 2,5 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл и 20 мг/мл. Для SAXS каждый образец измеряли 6 x 30 с, и данные регистрировали в диапазоне q от 0,08 нм-1 до 4 нм-1. Спектры UV/Vis регистрировались каждые 60 с для длин волн от 200 до 500 нм с временем усреднения 0,2 с на точку. Эквивалентный буфер измерялся в тех же условиях.

2.4 Температурная стабильность

Измеряли тиреоглобулин в концентрации 10 мг/мл. Образец нагревали со скоростью 5 К/мин с 5-минутной паузой перед каждым измерением SAXS. Для каждой температурной точки (между 293 К и 343 К) образец экспонировался в течение 12 х 30 с. После периода нагрева образец также охлаждался в несколько шагов. Спектры UV-Vis регистрировали каждые 30 с для длин волн от 200 до 500 нм с усреднением по времени 0,2 с на точку. Эквивалентный буфер измеряли в течение 30 х 30 с при 293 К.


3 Результаты

3.1 Измерения концентрации


  

Рис 2: UV/Vis спектры растворов ТГ ряда концентраций.

 Измерения отдельных образцов были усреднены и скорректированы относительно буфера, как для UV/Vis спектров (Рис. 2), так и SAXS (рис. 3А). Оба метода показывают существенное влияние концентрации на результаты. Измерительный капилляр имеет цилиндрическую форму, и фактический оптический путь трудно оценить из-за различной толщины образца и отражений от стенок капилляра. Поэтому данные SAXS были масштабированы с использованием значений поглощения только при 280 нм. Масштабированные кривые показывают хорошее согласование и могут быть использованы для дальнейшего анализа (рис. 3Б).


Рис. 3: Кривые рассеяния до (A) и после (Б) масштабирования с использованием UV/Vis поглощения на 280 нм.

 3.2      Температурная стабильность

Агрегация в абсорбционной спектроскопии обычно проявляется как ненулевое поглощение при 350 нм. Для SAXS более крупные агрегированные частицы вызывают увеличение интенсивности рассеяния в области малых углов (рис. 5A). Поэтому из каждого измеренного спектра UV/Vis и кривой SAXS были выделены поглощение при 350 нм и средняя интенсивность рассеяния в q-диапазоне (0,1 нм-1; 0,15 нм-1) (рис. 5Б). Обе кривые показывают типичное поведение плавящихся белков, однако график SAXS немного смещен относительно графика, полученного в эксперименте UV/Vis. Это указывает на то, что плавление может начаться уже при более низких температурах, и предполагает, что SAXS более чувствителен к ранним признакам денатурации белка, поскольку обнаруживает структурные изменения на ранней стадии.

  

Рис. 4 (A): Кривые рассеяния SAXS серии нагревания белкового раствора, показывающие агрегацию молекул белка.

 

Рис. 5 (B): График интенсивности рассеянного SAXS в диапазоне от q = 0,1 нм-1 до 0,15 нм-1 серии нагревания белкового раствора, показывающий агрегацию; поглощение при 350 нм в зависимости от времени эксперимента.


4        Выводы

Совмещение SAXS с UV/Vis абсорбционной спектроскопией на месте позволяет контролировать состояние образца взаимодополняющими средствами. Это дает информацию о точной концентрации в области прохождения пучка во время измерения SAXS, что полезно, например, для экспериментов эксклюзионной хроматографии (SEC) в сочетании с SAXS.

Эти два метода также дополняют друг друга при изучении агрегации белков, поскольку они работают с различными типами частиц. Помимо прямого научного значения, поглощение UV/Vis может помочь оператору SAXS в диагностике повседневных проблем, таких, как чистота капилляра, стабильность позиции образца в пучке и образование пузырьков.


Все поля, обозначенные звездочкой *, обязательны для заполнения
(0)