Введение
Уже много лет компания «Anton Paar» активно работает в области микромеханических испытаний биологических материалов и биоматериалов. После приобретения значительного опыта в испытании твердых биологических материалов, таких как дентин или кость, как в сухой, так и в жидкой среде, следующим естественным шагом стало развитие в области мягких тканей и материалов. Постоянно растущие потребности в испытаниях со стороны биологического и медицинского сообщества для характеристики мягких биологических и биосовместимых материалов привели к разработке методики локализованного испытания мягких материалов и подходящего устройства для испытания.
Природа образцов с очень низкой жесткостью (модуль упругости ~10 МПа и менее) диктовала требования к новому прибору и соответствующей технике наноиндентирования. Поэтому новый тестер наноиндентирования для биологов должен соответствовать следующим требованиям:
- Низкий диапазон нагрузок,
- Большой диапазон вертикальных перемещений,
- Возможность испытания погруженных образцов,
- Автоматизированная методика испытания образцов неправильной формы.
Кроме того, новое устройство наноиндентирования должно обладать функциями визуализации, хорошей термостойкостью, достаточной точностью поперечного перемещения для локализованного испытания и возможностью нагрева для воспроизведения биологических сред.
Рис. 1: Полный комплект прибора Bioindenter с блоком управления и нагревательной ячейкой
Прибор Bioindenter
Новый био-наноиндентер под названием Bioindenter был разработан в сотрудничестве со специалистами по биологии из отдела биологических наук Лаборатории организации «CSEM» (Швейцария). Это сотрудничество привело к адаптации и валидации протоколов наноиндентирования биологических образцов. Новый прибор Bioindenter способен выдерживать нагрузки от ~0,01 мН до 20 мН с общим ходом индентера более 100 мм. Bioindenter основан на успешном тестере ультрананоиндентирования (UNHT), от которого он унаследовал превосходную термическую стабильность и высокую чувствительность для измерений ползучести. Для измерения погруженных образцов и уменьшения капиллярных эффектов были разработаны специальные индентеры с тонким длинным стержнем.
Рис. 2 – Индентер с длинным валом для биоиндентирования.
Эти индентеры с длинным валом доступны в различных форматах. Наиболее часто используемые форматы - это сферы и плоские пуансоны. Для облегчения обработки и испытания биологических образцов Bioindenter включает в себя специально разработанный держатель чашки Петри, позволяющий легко переносить и переключать образцы. Для держателя чашки Петри имеется дополнительный нагреватель, позволяющий контролировать образцы при температуре до 50 °C. Приводные столы по осям XY с точностью перемещения 1 мм обеспечивают точное боковое позиционирование; приводной стол по оси Z позволяет автоматизировать подход и отвод индентера во время испытания. Микроскоп с дальними объективами и светодиодным источником света позволяет получать изображение образца сверху, а дополнительный микроскоп может быть установлен под образцом, чтобы обеспечить наблюдение за образцом на месте во время эксперимента.
Метод биоиндентирования
Протокол измерений для наноиндентирования биологических образцов (иногда называемый биоиндентированием) учитывает неровности поверхности образцов путем включения автоматической процедуры обнаружения поверхности в матрицу измерений. Обнаружение поверхности с помощью программного обеспечения для индентирования теперь обычно использует изменение жесткости контакта, чтобы избежать ложного обнаружения контакта из-за внешних сил (капиллярности и др.). Использование больших сферических индентеров облегчает обнаружение контакта на чрезвычайно мягких образцах (гидрогели, хрящи, скаффолды), обеспечивая большую жесткость контакта и усредняя поверхностную и структурную неоднородность. Проникновения, наблюдаемые при биоиндентировании, обычно находятся в диапазоне от десяти до нескольких сотен микрометров, что позволяет исследовать большой объем ткани, а не отдельные клетки. Биоиндентирование дает усредненные свойства материала, и поэтому методика требует относительно небольшого числа экспериментов.
Биоиндентирование может быть использовано для испытания хряща, сухожилия, роговицы, скаффолда, регенерации тканей, растений, сжатия микротканей, гидрогеля и эластомера (Эбенштейн и Пруитт, 2006 г.; Ойен, 2010 г.). В дополнение к модулю упругости Bioindenter также может оценивать ползучесть и пороупругие свойства этих материалов (Ху и соавт., 2010 г.; Кауфман и соавт., 2008 г.; Менчик и соавт., 2009 г.)
Применения прибора Bioindenter
Области применения Bioindenter очень широки. Многие ткани человека подвергаются механической нагрузке, и их механическая характеристика может предоставить ценную информацию о развитии заболеваний, лечении, а также разработки искусственных заменителей (имплантатов, скаффолдов). Биоиндентирование может быть использовано в диагностике заболеваний (функции печени, артерий) и для фундаментальных исследований по лечению этих заболеваний (Ху и соавт., 2012 г.; Левенталь и соавт., 2010 г.; Ойен, 2010 г.). Этот метод также находит свое применение в растущей области биомиметических исследований, где структура и механические свойства тканей должны быть тщательно охарактеризованы для разработки трансплантационных материалов со свойствами, максимально приближенными к реальным тканям. Механические свойства, полученные с помощью Bioindenter, тесно связаны с локальной структурой материала и раскрывают важную информацию о биомеханической реакции ткани.
Фундаментальным преимуществом биоиндентирования является его способность исследовать свойства биологических тканей в масштабе тканей, чтобы понять их механическое поведение. Это часто делается для поиска потенциальных заменяющих материалов, свойства и поведение которых должны точно соответствовать заменяемым тканям. Bioindenter предоставляет уникальный инструмент для испытания как тканей, так и их потенциальных заменяющих материалов.
Хрящ
Остеоартрит - одно из наиболее распространенных заболеваний суставов, которым страдает около пятидесяти процентов населения всего мира. Несмотря на некоторый прогресс, достигнутый в лечении этого заболевания, различные механизмы возникновения, распространения и воздействия медицинских методов лечения до конца не изучены. Поэтому многие лаборатории проводят исследования, которые основаны на характеристике механических свойств хряща на разных стадиях заболевания наряду с пониманием эффектов различных методов лечения. Эти эксперименты почти исключительно проводятся на небольших лабораторных животных, т.е. крысах или мышах, дающих очень маленькие образцы с небольшими участками испытания. Использование Bioindenter в этом исследовании обеспечивает подходящий диапазон нагрузки и глубины в сочетании с высоким боковым разрешением для испытания небольших образцов хряща. Результаты испытаний наноиндентирования будут использованы при разработке и оценке методов лечения остеоартрита и изучении различных эффектов на развитие остеоартрита. Одной из тем исследования также является отображение механических свойств хряща в зависимости от уровня нагрузки, приложенной к соответствующей зоне. Подробное исследование было проведено на бедренной кости крысы для определения свойств трех основных зон на бедре: передней зоны (1), задней зоны (3) и верхней зоны (3). Передняя и задняя зоны (1 и 3) слабо нагружены, тогда как верхняя зона (3) сильно нагружена в течение жизни крысы. Результаты измерения Bioindenter со сферическим индентером и бедренной костью, полностью погруженной в жидкость, показали, что высоконагруженная зона 2 имеет гораздо более высокий модуль упругости и меньшую ползучесть, чем передняя и задняя зоны (1 и 3). Это важное открытие, поскольку оно указывает на сильную неоднородность хряща и зависимость его свойств от механической нагрузки в течение жизненного цикла. Все индентирования были проведены с максимальной глубиной 15 мм (начало периода удержания). Различная жесткость и способность к течению жидкости (ползучести) отражались в различных максимальных силах, необходимых для достижения глубины 15 мм. Очевидно, что более нагруженная верхняя зона 1 намного жестче, чем слабо нагруженные зоны 1 и 3. Зоны 1 и 3 также демонстрируют большую ползучесть (в основном из-за потока жидкости), чем более жесткая зона 2. Этот пример показывает, что свойства ползучести также очень важны при характеристике биологических материалов.
Рис. 3 – Изображение Bioindenter во время индентирования хряща бедренной кости крысы (а) и реакция индентирования хряща в нагруженной и менее нагруженной области (b).
Регенерация тканей, скаффолды
Bioindenter также может быть использован для изучения степени регенерации после поражения хряща. Было проведено исследование эволюции регенерации хряща после введения скаффолда в очаг поражения бедренной кости козы. Животное было умерщвлено через три месяца после проведения трансплантации, и были испытаны как здоровые, так и регенерирующие участки хряща. Измерения прибора Bioindenter показали, что здоровый и регенерирующий хрящ демонстрируют большие различия как в модуле упругости, так и в поведении при ползучести. В этом случае испытуемая область была довольно большой (~несколько сотен микрометров), так что обычно присутствующие локальные вариации жесткости здорового и регенерирующего хряща были усреднены. Сильно локализованные измерения привели бы к разрозненным экспериментальным результатам, и выводы о ходе процесса заживления было бы трудно сделать. Измерения показали, что регенерирующий хрящ имел гораздо большую ползучесть и более чем в десять раз меньший модуль упругости, чем здоровый хрящ. Очевидно, что регенерация хряща находится на очень ранней стадии даже спустя три месяца после трансплантации.
Рис. 4: Изображение Bioindenter во время индентирования бедренной кости козы (а) и сравнение наноиндентирования на здоровом и регенерирующем хряще (бедренная кость козы, сферический индентер радиусом 0,5 мм (b).
Роговица
Роговица, корнеосклеральный край и склера представляют собой области глаза, которые играют важную роль для хорошего зрения. Некоторые заболевания или травмы роговицы могут привести к частичной или полной слепоте или хронической боли в глазной поверхности. Лечение таких случаев может основываться на восстановлении стволовых клеток, расположенных в лимбальной области. Выживание и самообновление лимбальных стволовых клеток сильно зависит от биомеханических свойств окружающей среды, т.е. роговицы, корнеосклерального края и склеры. Поэтому большой интерес представляет изучение модуля упругости и проницаемости корнеосклерального края для оценки биомеханических свойств этой уникальной структуры на поверхности глаза. Некоторые методы лечения роговицы (такие как поперечное сшивание с использованием ультрафиолетовых лучей спектра А (УФА)) также могут влиять на жесткость и проницаемость роговицы. Измерение этих изменений является важным фактором для определения эффективности метода лечения. В нашем исследовании Bioindenter использовался для индентирования трех различных областей глаза (роговицы, лимба и склеры), чтобы получить модуль упругости и сравнить свойства ползучести (способность потока жидкости при механической нагрузке) в этих областях.
Foto5a
Рис. 5: Различные области глаза (а) и глубина индентирования в зависимости от времени для трех областей глаза: склеры, лимба и центральной роговицы (индентирование с нагрузкой 0,05 мн, удерживание 180 секунд, сферический индентер радиусом 0,5 мм) (b). Обратите внимание на различную глубину индентирования и уровни ползучести для каждой области.
Гидрогели
Гидрогели - это очень мягкие материалы, подходящие для тканевой инженерии, которые используются в различных областях биологических и клинических исследований, например, для борьбы с остеопорозом или кровотечениями. Многие гидрогели рассматриваются в качестве потенциальных кандидатов для замены, регенерации, скаффолдов или в качестве субстратов для роста мягких тканей в организме человека. Недавно было обнаружено, что эластичность субстрата может существенно влиять на гомеостаз тканей, что важно для регенерации тканей (Дишер и соавт., 2005 г.; Моерс и соавт., 2013 г.). Поэтому определение упругих – и в целом механических – свойств биологических субстратов представляет большой интерес. Модуль упругости и свойства ползучести могут быть легко изучены с помощью прибора Bioindenter, поскольку он совместим с испытаниями в жидкостях и может работать в различных режимах нагрузки (Нохава и соавт., 2014 г.). Затем можно легко изучить зависящий от времени отклик гидрогелей.
Рис. 6 – Настройка прибора Bioindenter для индентирования гидрогеля (а) и кривых глубины индентирования для гидрогеля из полиакриламида с различными концентрациями (максимальная нагрузка 0,05 мН, период удерживания 100 секунд, сферический рубиновый индентер с R=0,5 мм) (b).
Адгезия – эластомеры и гели
Метод биоиндентирования применяется не только для индентирования биологических материалов, но и для измерений различных эластомеров, гелей и гидрогелей, которые не требуют погружения в жидкость. Такие материалы часто могут проявлять очень эластичное поведение и сильную адгезию (Кон и Эбенштейн, 2013 г.). Эти явления могут быть изучены с помощью Bioindenter и его способности детектировать очень малую силу на индентере во время приближения и отвода индентера от поверхности материала. По мере приближения индентера к поверхности адгезия при натяжении создает пик нормальной силы. Это явление регистрируется на кривой нагрузка-смещение и может быть использовано для расчета силы адгезии или поверхностной энергии. Во время отвода, когда индентер удаляется с поверхности, адгезия при отрыве создает отрицательные силы адгезии и также может быть измерена.
Рис. 7 – Адгезия на геле во время сферического индентирования с использованием прибора Bioindenter и уравнения, основанного на теории Джонсона, Кендалла, Робертса (JKR) для расчета поверхностной энергии W12 (где R - радиус индентера, а Fad - сила адгезии при отрыве (Менчик, 2012 г.).
Заключения
Наноиндентирование биологических тканей (биоиндентирование) - это развивающаяся область, которая имеет много особенностей и требует новых экспериментальных и аналитических подходов. Несмотря на то, что это относительно новый метод, он уже нашел свое применение во многих лабораториях по всему миру и служит как для разработки клинических методов лечения, так и для фундаментальных биомеханических исследований. Первоначальное отсутствие детектирующих приборов недавно было устранено компанией «Anton Paar» при помощи прибора Bioindenter. Bioindenter предоставляет уникальные возможности для локальной характеристики биологических материалов in vitro для изучения их поведения и отклика на механическую нагрузку. Еще одним большим преимуществом Bioindenter является способность измерять зависящие от времени свойства, часто связанные с потоком жидкости в тканях, что является важным фактором в понимании жизни и поведения многих мягких тканей.
Авторы
Доктор Джири Нохава, компания «Anton Paar TriTec SA»
